Genetik tədqiqatların aparılması prosesində biz tez-tez qeyri-kafi RNT nümunələri ilə qarşılaşırıq, məsələn, kiçik anatomik ağız şişlərini, hətta tək hüceyrəli nümunələri və insan hüceyrələrində çox aşağı səviyyədə transkripsiya edilmiş xüsusi gen mutasiyalarının nümunələrini öyrənmək üçün.Əlbəttə ki, COVID-19 testi üçün, əgər tamponlar düzgün yerdə deyilsə və ya nümunə götürmə zamanı kifayət qədər vaxt yoxdursa, nümunənin ölçüsü çox az olacaq, buna görə Səhiyyə və Ailə Planlaması Komissiyası iki gün əvvəl çıxdı və testdən keçdi və nuklein turşusu nümunə götürən altı nümunə götürməyibsə, bu barədə məlumat verə bilərsiniz.
Reagentin həssaslığı vacibdir, çünki bizdə bu və ya digər problem var, onda RT-PZR-in həssaslığını artırmaq üçün nə edə bilərik?
Mümkün həll yollarını müzakirə etməzdən əvvəl, qeyd etdiyimiz vəziyyətlə bağlı iki böyük fəsadı qeyd edək.
Əvvəla, nümunəmizdə yalnız bir neçə hüceyrə populyasiyası olduqda RNT itkisindən narahat oluruq.Sütun üsulu və ya nuklein turşusu çökdürmə üsulu kimi ənənəvi ayırma və təmizləmə üsullarından istifadə olunarsa, bir neçə nümunənin itirilməsi ehtimalı yüksəkdir.Bir həll yolu tRNT kimi bir daşıyıcı molekul əlavə etməkdir, lakin buna baxmayaraq, bərpa təcrübəmizin yaxşı olduğuna dair heç bir zəmanət yoxdur.
Yaxşı yol nədir?Becərilmiş hüceyrələr və ya mikroanatomik nümunələr üçün yaxşı seçim birbaşa lizizdən istifadə etməkdir.
İdeya 5 dəqiqə ərzində hüceyrələri parçalamaq, RNT-ni məhlula buraxmaq, sonra reaksiyanı 2 dəqiqə dayandırmaq, daha sonra heç bir RNT itirilməməsi üçün lizatı birbaşa əks transkripsiya reaksiyasına əlavə etmək və nəhayət, nəticədə cDNT-ni birbaşa qoymaqdır. real vaxt reaksiyasına daxil olur.
Bəs məhdud bir başlanğıc nöqtəsi və ya az miqdarda hədəf gen ifadəsi səbəbindən bütün RNT-ni təkrar emal edə bilsək və hələ də yaxşı real vaxt siqnalı almaq üçün kifayət qədər şablon təqdim etməsək nə olar?
Bu halda, gücləndirmə öncəsi addım çox faydalı ola bilər.
Aşağıdakılar əks transkripsiyadan sonra həssaslığı artırmaq üçün bir sxemdir.Başlamazdan əvvəl biz hansı hədəflərlə maraqlandığımızı soruşmalıyıq ki, bu hədəflər üçün əvvəlcədən gücləndirmə üçün xüsusi primerlər tərtib edək.
Buna 100 cütə qədər primer və 10-14 dəfə reaksiya dövrü olan qarışıq primer yaratmaqla nail olmaq olar.Buna görə də, alınan cDNA-nı əvvəlcədən gücləndirmək üçün xüsusi olaraq bu tələb üçün hazırlanmış Master Mix lazımdır.
Dövrlərin sayının 10 ilə 14 arasında təyin edilməsinin səbəbi, bu məhdud sayda dövrün müxtəlif hədəflər arasında təsadüfiliyi təmin etməsidir ki, bu da kəmiyyət molekulyar məlumatlara ehtiyacı olan tədqiqatçılar üçün çox vacibdir.
Əvvəlcədən gücləndirmədən sonra biz çox miqdarda cDNA əldə edə bilərik ki, arxa tərəfdəki aşkarlama həssaslığı çox yaxşılaşdırılsın və biz hətta nümunəni sulandıra və mümkün təsadüfi səhvləri aradan qaldırmaq üçün çoxlu real vaxt PCR reaksiyaları həyata keçirə bilərik.
Göndərmə vaxtı: 11 aprel 2023-cü il